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CRISPR/Cas9基因敲除

來(lái)源:萬(wàn)物   發(fā)布時(shí)間:2021-08-31

CRISPR/Cas9基因敲除

CRISPR(clustered,regularlyinterspaced,shortpalindromicrepeats)是一種來(lái)自細(xì)菌降解 入侵的病毒DNA或其他外源DNA的免疫機(jī)制。在細(xì)菌及古細(xì)菌中,CRISPR系統(tǒng)共分成3類(lèi),其中類(lèi)和類(lèi)需要多種CRISPR相關(guān)蛋白(Cas蛋白)共同發(fā)揮作用,而類(lèi)系統(tǒng)只需要一種Cas蛋白即可,這為其能夠廣泛應(yīng)用提供了便利條件。

目前,來(lái)自StreptococcuspyogenesCRISPR-Cas9系統(tǒng)應(yīng)用最為廣泛。Cas9蛋白(含有兩個(gè)核酸酶結(jié)構(gòu)域,可以分別切割DNA兩條單鏈。Cas9首先與crRNAtracrRNA結(jié)合成復(fù)合物,然后通過(guò)PAM序列結(jié)合并侵入DNA,形成RNA-DNA復(fù)合結(jié)構(gòu),進(jìn)而對(duì)目的DNA雙鏈進(jìn)行切割,使DNA雙鏈斷裂。 由于PAM序列結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單(5’-NGG-3’),幾乎可以在所有的基因中找到大量靶點(diǎn),因此得到廣泛的應(yīng)用。CRISPR-Cas9系統(tǒng)已經(jīng)成功應(yīng)用于植物、細(xì)菌、酵母、魚(yú)類(lèi)及哺乳動(dòng)物細(xì)胞,是目前最高效的基因組編輯系統(tǒng)。

通過(guò)基因工程手段對(duì)crRNAtracrRNA進(jìn)行改造,將其連接在一起得到sgRNAsingleguideRNA。融合的RNA具有與野生型RNA類(lèi)似的活力,但因?yàn)榻Y(jié)構(gòu)得到了簡(jiǎn)化更方便研究者使用。通過(guò)將表達(dá)sgRNA的原件與表達(dá)Cas9的原件相連接,得到可以同時(shí)表達(dá)兩者的質(zhì)粒,將其轉(zhuǎn)染細(xì)胞,便能夠?qū)δ康幕蜻M(jìn)行操作。

作為一種新的基因編輯技術(shù),CRISPR/Cas9有以下特點(diǎn)和優(yōu)勢(shì)

1、靶向精確性更高。RNA靶向序列和基因組序列必須完全匹配,Cas9才會(huì)對(duì)DNA進(jìn)行剪切。

2、可實(shí)現(xiàn)對(duì)靶基因多個(gè)位點(diǎn)同時(shí)敲除。

3、實(shí)驗(yàn)周期短,最快僅需2個(gè)月,節(jié)省大量時(shí)間和成本。

4、無(wú)物種限制。

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