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雙熒光素酶報告基因檢測

來源:萬物   發(fā)布時間:2021-08-31

雙熒光素酶報告基因檢測

一、檢測原理

全基因合成miR潛在結(jié)合位點上下游~500bpLncRNAcircRNAmRNA3UTR)野生形式WT及結(jié)合位點的突變形式Mut,克隆到psiCHECK-2多克隆位點處(1640-1674)(圖1),然后與miRmimics/NC共同轉(zhuǎn)染293T細胞測定熒光素酶讀值即可。

二、載體構(gòu)建與Mimics合成

1、構(gòu)建WT miR潛在結(jié)合位點到psiCHECK-2載體,命名為WT;

2、構(gòu)建Mut miR潛在結(jié)合位點到psiCHECK-2載體,命名為Mut(突變模式:A/TG/C互變);

3合成待測miRMimmics及陰性對照NC。

三、 實驗分組信息



psiCHECK- Target 序列

miR

Target-1

1

WT

NC

2

WT

Mimics

3

Mut

NC

4

Mut

Mimics

Target-2

1

WT

NC

2

WT

Mimics

3

Mut

NC

4

Mut

Mimics

四、具體實驗步驟:

(細胞轉(zhuǎn)染操作步驟

1、事先準備好用于轉(zhuǎn)染的分到96孔板中的293T 細胞和目的質(zhì)粒,待細胞密度達到50%-70%為宜。

210 ml DMEM0.16 mglncRNA (circRNA/3’UTR)/Mut目的質(zhì)粒以及5 pmolmiR/Negative.ControlN.CMimics充分混勻后室溫放置(溶液A);然后將10 ml DMEM0.3 ml 的轉(zhuǎn)染試劑(轉(zhuǎn)染試劑為漢恒生物產(chǎn)品LipoFiter,濃度為0.8 mg/ml)充分混勻(溶液B),室溫放置5 min。

3將溶液A與溶液B充分混勻,室溫放置20 min

4、轉(zhuǎn)染前為細胞換取新鮮培養(yǎng)基,之后將轉(zhuǎn)染混合物加入混勻。37℃,5% CO2培養(yǎng)。

5、轉(zhuǎn)染6 h后換取新鮮培養(yǎng)基,轉(zhuǎn)染48 h后收集細胞檢測。

(檢測實驗操作步驟

檢測試劑盒:Promega Dual-Luciferase system

1、將5′PLB (Passive Lysis Buffer)用蒸餾水稀釋至1′PLB,以96孔板每孔100 ml的量加入,用移液槍吹打打散細胞,置于室溫搖床上緩慢搖15分鐘后,將細胞裂解液吸至1.5 ml離心管,412000 rpm 13200g)離心10 min,取上清移入新的管子;

296孔板中加入Luciferase Assay Reagent II (LAR II)( Luciferase Assay Reagent, Progema)工作液100 ml;

3、加入20 ml細胞裂解液,移液槍吹打混勻2-3次,測定記錄Firefly luciferase值,此值為內(nèi)參值。

4、加入100 ml Stop & Glo? Reagent(Luciferase Assay Reagent, Progema),移液槍吹打混勻2-3次,測定記錄Renilla luciferase值,此即為報告基因發(fā)光值。

五、 預(yù)期實驗結(jié)果



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