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SweScript RT I First Strand cDNA Synthesis Kit (With gDNA Remover)
價格：
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貨號：
SJ21585
產品規(guī)格：
50 rxns
購買數量：
產品詳情
操作說明
注意事項
產品簡介
本產品利用改造后的突變體逆轉錄酶以總RNA或mRNA為模板，高效逆轉錄合成第一鏈cDNA，試劑盒中包含合成高質量第一鏈cDNA所需的全部試劑，并提供兩種cDNA合成引物供選擇：Random Hexamer Primer和Oligo (dT)18 Primer，合成的單鏈cDNA產物可直接用來進行后續(xù)PCR或qPCR反應。SweScript RT I (Reverse Transcriptase)是基于M-MLV Reverse Transcriptase并通過體外進化篩選獲得的突變體逆轉錄酶，SweScript RT I無RNase H活性，避免了第一鏈cDNA合成反應中DNA/RNA雜交體模板中RNA被降解，從而保證第一鏈cDNA合成量和長度；與野生型酶相比，SweScript RT I的熱穩(wěn)定性和合成效率大幅提高，可在42-55℃范圍內高效合成cDNA，同時也可合成長達10 kb的cDNA。
本試劑盒中同時提供gDNA Remover試劑，可在逆轉錄步驟前快速去除RNA模板中殘留的基因組DNA污染，提高實驗結果的可信度，并可簡化qPCR引物設計，無需跨外顯子設計引物。
儲存與運輸
冰袋（wet ice）運輸；
-20℃保存，12個月有效期。
組成
|
Component Number |
Component |
G3331-50 |
G3331-100 |
|
G3331-1 |
SweScript RT I Enzyme Mixa |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-2 |
5×Reaction Bufferb |
200 μL |
400 μL |
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G3331-3 |
Oligo (dT)18 Primer (100 μM) |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-4 |
Random Hexamer Primer (100 μM) |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-5 |
gDNA Remover |
50 μL |
100 μL |
|
G3331-6 |
10×gDNA Remover Buffer |
50 μL |
100 μL |
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G3331-7 |
Nuclease-Free Water |
1 mL |
1 mL |
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說明書
|
1份
|
1份 |
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a：含有RNase Inhibitor；
b：含有dNTP Mixture和Mg2+。
操作步驟
1. 基因組去除
(1) 將RNA模板，Nuclease-Free Water置于冰上融解備用；
(2) 基因組去除反應(推薦10 μL反應體系)：
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Component |
Volume |
|
10×gDNA Remover Buffer |
1 μL |
|
gDNA Remover |
1 μL |
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Total RNA/mRNA |
0.1 ng-5 μg / 10 pg-0.5 μg |
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Nuclease-Free Water |
Add to 10 μL |
(3) 輕輕混勻并離心；
(4) 37℃孵育2 min后置于冰上備用;
2. 第一鏈cDNA合成
(1) 逆轉錄反應體系配制（推薦20 μL反應體系）；
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Component |
Volume |
|
上一步基因組去除反應液
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10 μL |
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5×Reaction Buffer |
4 μL |
|
Oligo (dT)18 Primer (100 μM) |
1 μL |
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or Random Hexamer Primer (100 μM) |
or 1 μL |
|
or Gene Specific Primer (2 μM) |
or 1 μL |
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SweScript RT I Enzyme Mix |
1 μL |
|
Nuclease-Free Water |
Add to 20 μL |
注：針對高GC或復雜模板，可預先混合RNA模板、逆轉錄引物、無核酸酶水并在65℃保溫5 min后，迅速置冰上冷卻。然后再加入其他反應組分。
(2) 輕輕混勻并離心；
(3) 逆轉錄程序設置：
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Temperature |
Time |
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25℃a |
5 min |
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50℃b |
15-30 min |
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85℃ |
5 s |
a：如選擇使用Random Hexamer Primer，25℃孵育5 min后，再進行后續(xù)反應；如選擇使用Oligo (dT)18 Primer或Gene Specific Primer，可直接進行50℃反應；
b:對于高GC或復雜模板，可將逆轉錄溫度提高至55℃。
注意事項
1. 操作時請佩戴一次性手套，避免RNase污染。
2. 逆轉錄產物可以-20℃短期保存，若需長期保存，建議分裝后，于-80℃保存，避免反復凍融。
3. 如模板為真核生物來源，建議選擇Oligo (dT)18 Primer，與真核生物mRNA的3' Poly A尾配對，可獲得最高產量的全長cDNA。
4. 原核生物RNA逆轉錄請選用Random Hexamer Primer或Gene Specific Primer。
5. Random Hexamer Primer適用性較廣，適用于mRNA、rRNA、tRNA、small RNA和LncRNA等模板。
6. 如逆轉錄后續(xù)為qPCR實驗，可將Oligo (dT)18 Primer與Random Hexamer Primer混合使用，可使mRNA的各個區(qū)域cDNA合成效率相同，有助于提高定量結果的真實性和重復性。
7. 如后續(xù)qPCR引物跨外顯子設計，基因組去除步驟可省略。
產品僅供科研用途，不用于臨床診斷！
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